标题：Gut microbiota mediates intermittent-fasting alleviation of diabetes-induced cognitive impairment
杂志：NATURE COMMUNICATIONS
影响因子：11.878
样本类型及数目：148 只小鼠
测序技术：肠道菌群（16S rDNA）、血浆代谢组、大脑转录组
关键词：2型糖尿病、肠脑轴、间歇性禁食
Homozygous Leprdb/db mice 为糖尿病模型；heterozygous Leprdb/m mice 为对照。
研究背景
2型糖尿病的（T2D）可引起多种并发症，脑微血管损伤、神经炎症、认知衰退等神经疾病。已有研究表明，肠道菌群在饮食与宿主生理和病理学的联系中起着至关重要的作用，肠道微生物群的代谢产物（例如短链脂肪酸（SCFA）、3-吲哚丙酸（IPA）、胆汁酸（BAs）和5-羟色胺（5-HT））能够通过血脑屏障，调节大脑能量代谢、突触传递等认知功能。饮食限制在代谢综合症和寿命延长方面是有益的，肠道菌群可能在这方面起着关键作用。间歇性禁食（IF）方案能够延长寿命、促进能量代谢，并减少各种与年龄相关疾病的风险。但是，IF对T2D认知缺陷的保护作用尚不清楚。
主要结果
间歇性禁食抑制胰岛素抵抗和认知障碍
2型糖尿病小鼠进行28天间歇性禁食（IF）实验示意图可见图1a，与同窝对照小鼠的db / m组相比，db / db小鼠的食物/能量摄入较高（图 1c，d）（采用Tukey检验的ANOVA，p <0.01）。IF降低了db / db小鼠的体重（图 1b）（采用Tukey检验的ANOVA，p <0.01），但是并没有改变它们的总能量摄入（图 1c，d）。同时，第28天胰岛素耐受性试验显示，与自由喂养的小鼠相比，IF治疗通过抑制空腹血糖水平（降低54.8％）和空腹胰岛素水平（降低29.8％）来提高db / db小鼠的胰岛素敏感性（图 1f，g）。db / db小鼠经IF治疗后，胰岛素抵抗相关HOMA-IR值降低（图 1h）。此外，IF 显着降低了附睾白色脂肪组织（eWAT）的质量和脂肪细胞的大小（补充图 1B–D）（采用Tukey检验的ANOVA，p <0.01）。进行莫里斯水迷宫测试以评估IF对糖尿病小鼠固有的认知障碍的影响。在5天的导航测试中，IF降低了逃逸潜伏期，表明db / db小鼠的认知能力得到改善（图 1i；补充图 1E）。在空间探索实验中，IF组db / db小鼠需要花费更多的时间进行靶标识别（A Tutu's测试，P <0.05），这反映出糖尿病小鼠的空间记忆增加（图 1j）。高架十字迷宫焦虑行为测试结果表明，IF治疗可以改善db / db小鼠的焦虑行为和运动能力（补充图 1F–H）。图1. db / db小鼠的间歇性禁食减轻了胰岛素抵抗和认知障碍
IF能够改善突触超微结构和胰岛素信号海马体是参与认知和记忆的大脑主要区域，对后突触密度分析结果显示，与db / db组（图2b，c）相比，db / db-IF小鼠的PSD长度和宽度均增加 （图瓦克检验的ANOVA） ，p ＜0.01）。为了评估IF是否可以改善脑胰岛素抵抗，作者评估了海马体中胰岛素信号的传导。结果显示，IF能够增加了IRS1 -Tyr 896 / IRS1和Akt的磷酸化，表明它刺激了海马胰岛素信号传导途径（图 2d）。同时，IF治疗可增强BDNF（一种涉及维持神经元存活和突触功能的神经营养因子）的表达，并增强ERK / CREB的磷酸化（BDNF合成的上游信号）（图 2e）（采用Tukey检验的方差分析，p <0.05）。同样，在IF处理的小鼠海马中，兴奋性后突触密度中支架蛋白PSD-95的表达也增加了（图 2e），符合PSD的超微结构改变。图2：间歇性禁食改善了db / db小鼠大脑中突触的超微结构，并改变了IRS / Akt和CREB / ERK信号传导。IF促进海马线粒体生物发生为了确定海马中IF调控的关键生物学过程和途径，作者通过转录组测序总共检测到27,094个基因（包括1345个新的无注释新预测基因）。差异分析结果显示（DEG）（DEG-group 1基因），发现与db / db和db / m小鼠相比，db / db-IF小鼠中有1181个基因高表达（FDR- p <0.05 ），GO注释结果中大多数与大多数与线粒体相关。DEG-group 6基因的GO项分析表明db / db小鼠的呼吸链和线粒体裂变/翻译生物学过程失调，这提示糖尿病小鼠中的线粒体代谢异常。值得关注的是，相关的线粒体相关基因表达在IF小鼠中有所改善（图 3a）。db / db小鼠的海马体中483个基因的表达与IF组（DEG- 第 3组和第6组）db / m小鼠中的水平相当（FDR- p <0.05）。同时，IF组中与氧化磷酸化的KEGG途径（OXPHOS）有关的基因上调（图 3b），说明IF处理改善了db / db小鼠中下调的OXPHOS中与能量代谢相关的基因表达（补充图 3B）。随后，对所有27,094个基因进行了加权基因共表达网络分析（WGCNA），总共鉴定获得5个包含功能和生物学相关基因的模块（补充图 3C）。值得注意的是，“ MEbrown”模块与IF高度相关（r = 0.892，p = 2e-11）（补充图 3D），同时大多数已鉴定的基因与线粒体和代谢功能；氧化磷酸化过程，亨廷顿氏病，AD，帕金森氏病KEGG途径相关（图 3c，d；补充数据 5）。为了证实RNA测序分析数据是否与基因表达一直，作者通过qPCR分析证实IF能够上调db / db小鼠与线粒体代谢相关基因（补充图 3F）。通过比较db / db小鼠中海马中的mtDNA / nDNA比值变化（图 3g）（采用Tukey检验的ANOVA，p <0.01），表明线粒体基因上调可能是一种后果线粒体质量增加。进一步探究db / db-IF组线粒体生物发生上调的潜在潜在机制（图 3e），作者通过PGC1α和AMPK / mTOR Western blot实验发现，IF导致线粒体生物发生的主要调控物PGC1α的蛋白质表达显着增加；这与线粒体相关基因的上调建立了强烈的相关性（补充图 3F）。与先前的研究一致，IF增强了AMPK的激活，该激酶介导对禁食状态敏感的细胞能量代谢（图 3e），并抑制了mTOR的磷酸化，mTOR是一种真核细胞营养传感器，在调节线粒体质量控制中起着至关重要的作用。图3：间歇性禁食改善了海马体的能量代谢和线粒体生物发生IF重组肠道菌群和微生物代谢产物肠屏障的完整性对维持肠通透性和预防内毒素血症至关重要，并且还与糖尿病及其并发症有关。因此，我们通过评估绒毛长度，肌层厚度和杯状细胞数量，研究了IF 对肠屏障完整性的影响。结果表明，IF增加了糖尿病小鼠的绒毛长度和肌层厚度，但对杯状细胞的数量没有影响（补充图 4A–D）。此外，通过Ussing Chamber对结肠的通透性的评估，我们观察到IF预防了肠道渗漏并伴随血浆LPS水平下降（补充图 4G，H）（采用Tukey检验的ANOVA，p <0.01）。这也与肠屏障中紧密连接蛋白claudin-1的表达在db / db-IF结肠组织中升高（补充图 4A，E，F）所指表型一致。随后通过细菌16S rRNA基因v3-v4扩增子的方式探究肠道的微生物的变化（第0天（基线水平）和第28天）。α多样性在经过28天的IF处理后仍显着增加（图 4a）（Kruskal–Wallis，p <0.05）。db / db-IF小鼠在第28天的未加权Unifrac距离与其他组不同，这表明IF方案同时改变了β多样性（图 4b）（p <0.05）。以时间为背景，不同的饮食和鼠类基因型是肠道微生物组形成的主要因素，分别为总变异的5.9％和7.7％（图 4c）。IF处理可改善乳酸杆菌和产生丁酸的奥德杆菌，同时降低肠球菌，链球菌和未知肠球菌（图 4d；补充数据 6）（ANCOM，p <0.05）。与db / db组相比，在db / m和db / db-IF 组中，假丝酵母菌，Rummeliibacillus，未知肠球菌和乳杆菌目的细菌数量均较低（图 4d）。图4：断食空腹治疗的db / db小鼠的肠道微生物组和血浆代谢组学分析考虑到小鼠基因类型的影响，我们在第28天评估了db / db小鼠和db / db-IF组的微生物群组成。总共发现有17个受IF影响的rOTU，其中5个属于乳杆菌（图 4e）。同时，PICRUSt分析揭示了11种不同的丰富的KEGG基因途径（FDR- p <0.1）。其中，db / db-IF组初级和次级胆汁酸的生物合成丰富（图 4f；补充数据 8）。IF治疗能够对肠道菌群产生了巨大影响，我们猜想是否与微生物代谢物或肠道菌群调节有关。通过血浆样品非靶向代谢谱分析显示，在db / db小鼠中IF处理28天后，许多代谢物发生了明显变化（补充图 5C，D）。在这些代谢产物中，IF增加了5-HT，色氨酸，对羟基苯乙酸，N-乙酰基色氨酸，肉桂酰甘氨酸，IPA和胆汁酸的血浆水平，例如胆酸（CA），脱氧胆酸（DCA），鼠李酸（MCA）和TUDCA与随意喂养的db / db小鼠相比（Wilcoxon秩和检验，p <0.05）。相比之下，db / db-IF组的酪氨酸，苯基乙酰基甘氨酸，苯基丙酰甘氨酸，对甲酚和对甲酚硫酸盐以及12-羟基二十碳五烯酸（12-HEPE）低于db / db组（图。4g）（Wilcoxon秩和检验，p ＜0.05）。另外，比较28天后治疗组，IF改善了db / db小鼠的乙酸盐，丙酸盐和丁酸盐水平（补充图 4I–K）（采用Tukey检验的ANOVA，p <0.05）。需要注意的是，血浆中的SCFA浓度很低，因此本实验中使用非靶向代谢组学无法准确检测的。多组学分析首先作者评估了IF上调的 hub基因n = 36，IF改变的OTU（n = 17），血浆微生物代谢产物（n = 23）和三个粪便SCFA，即，乙酸盐，丁酸盐和丙酸盐，用于评估小鼠的IF的状态。预测建模是通过将部分最小二乘法判别分析并入双重交叉验证框架（rdCV-PLSDA）中进行的。结果显示，最佳选择的主要预测因子包括几种肠道菌群，即乳酸杆菌，拟杆菌和Facklamia；微生物代谢物，如胆汁酸，IPA，5-HT，色氨酸，羟基色酚和硫酸吲哚酚，以及富含线粒体，核糖体的基因 或与代谢相关的GO term（图5b，c；补充图6C）。关键预测指标同样高度相关（图5d）。图5：与IF处理相关的多OMICS集成模型的策略和模型性能IF治疗通过肠道菌群发挥功能为了证明肠道菌群在介导固有的糖尿病认知缺陷中的关键作用，我们试图调查在db / db小鼠中去除肠道菌群后，IF的有益作用是否会受到影响。在4周IF方案开始前14天和整个实验中，在饮用水中给小鼠施用抗生素，并在28天后评估行为改变（补充图 8A，B）。抗生素治疗减弱了IF治疗的减肥效果（图 6a）（采用Tukey检验的ANOVA，p <0.05）。抗生素治疗对eWAT体重没有影响，但会增加肝脏和盲肠的体重（补充图 8E–G）。IF和抗生素治疗均可减少db / db小鼠的食物和水分摄入（补充图。8C，D）。但是，抗生素的使用对IF 对胰岛素抵抗的有益作用没有影响（补充图 8H-K）。值得注意的是，通过与IF相关的Morris水迷宫测试评估的认知改善已通过抗生素治疗而部分取消，在测试的第5天更长的逃逸时间和在探针测试的目标象限中更低的逃逸时间（补充图） 。图6B ;图 8L中，M）。此外，在db / db-IF小鼠中上调的线粒体生物发生被抗生素治疗所抵消（图 6c）。PSD的分析（图 6d，e）显示，通过抗生素治疗，db / db-IF小鼠中PSD的宽度减小了（采用Tukey检验的ANOVA，p <0.01）。这些结果共同表明，微生物群缺失使得IF对认知功能的保护功能减弱。此外，与db / db-IF组相比，我们发现通过抗生素处理去除肠道菌群可显着降低db / db小鼠的血浆IPA和粪便SCFA（补充图 9，补充数据 10）（ANOVA与Tukey检验，p <0.01）。图6：抗生素和微生物代谢产物对经IF处理的db / db小鼠认知功能的影响微生物代谢产物改善认知功能进行了另一项动物研究，以研究在抗生素治疗组中IF调节的微生物代谢产物（特别是IPA和SCFA）的减少在改善认知缺陷中的作用。在db / db小鼠中，所有这些代谢物的施用均可分别改善认知功能和胰岛素敏感性（图 6g；补充图 10C–H）（采用Tukey检验的ANOVA，p <0.05）。这些代谢物的给药还增强了线粒体的生物发生并保护了突触的超微结构（图 6h-j），与IF治疗的有益作用一致。此外，TUDCA的治疗抑制了db / db小鼠的体重增加（图6f），但所有代谢物处理均对db / db小鼠的食物摄入和水摄入没有影响（补充图 10A，B）。尽管代谢产物的治疗剂量高于IF方案组小鼠，但这些结果部分评估了这些代谢产物在IF方案中的起因和作用。编者说研究结果显示，28天间歇性禁食（IF）能够通过改变肠道菌群组成，进而通过改变代谢物水平，增强大脑海马体中的线粒体生成和能量代谢基因表达，从而发挥了神经保护作用，改善行为障碍。作者在其中设计大组及各小组模型处理方案值得关注，IF疗法可通过重组肠道菌群和代谢产物来改善脑能量代谢和认知功能，改善了糖尿病相关的认知功能障碍，并增加了线粒体的生物发生。作者通过抗生素治疗消除了糖尿病小鼠的肠道菌群后，IF对认知功能的有益作用被抑制了，表明微生物群组成及其衍生的代谢产物在介导IF诱导的神经元作用中起着关键作用。IF疗法和抗生素联合治疗代谢综合征的效率值得进一步研究。进一步研究微生物群变化传递到大脑的分子途径，对代谢相关的认知缺陷新治疗靶点开发具有长远意义。IF治疗可重组肠道微生物组并改变微生物代谢产物，上调海马体线粒体的生物发生和能量代谢，保护突触超微结构，并减轻认知和空间记忆障碍。我们可以进一步在临床试验中评估IF对微生物/代谢物/基因变化的影响，转化作为调控代谢和神经退行性疾病的新型生态方法。
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